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    CRISPR-Cas9系統:慢病毒轉染

    發布時間: 2024-04-29  點擊次數: 360次

    CRISPR慢病毒轉染法是一種高效引入CRISPR基因編輯系統到目標細胞中的技術,旨在實現對基因的有針對性編輯或調控。


    實驗步驟:

    1.質粒構建:構建好含有CRISPR-Cas9系統的質粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。該質粒攜帶

    sgRNA序列,可指導Cas9蛋白準確識別并切割目標。


    2.慢病毒包裝質粒:準備慢病毒包裝質粒,其中包括pCMV-VSV-G(攜帶包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(攜帶包裝蛋白)。這兩者協同作用,使得慢病毒能夠高效地傳遞CRISPR-Cas9系統到目標細胞內。


    3.細胞培養:使用適宜的培養基培養目標細胞,通常選擇293T細胞,以確保細胞處于最佳的生長狀態。


    4.轉染試劑準備:在進行轉染前,將培養基更換為適用于陽離子脂質體轉染的Opti-MEM減血清培養基。同時,準備轉染試劑,包括Lipofectamine 3000、助轉劑P3000以及含有CRISPR-Cas9系統的質粒。

    CRISPR-Cas9系統:慢病毒轉染

    5.轉染操作:將質?;旌衔锱c轉染試劑按照試劑盒的推薦比例進行混合,隨后滴加到目標細胞上,此過程中,確?;旌衔锱c細胞充分接觸,有利于轉染效率的提高。


    6.培養條件:將細胞置于37°C、5%CO2的培養箱中,培養一定的時間,通常在48小時內。


    7.收獲:收集細胞上清液,通過離心去除細胞殘渣。


    8.濾膜過濾:使用0.22 μm孔徑的聚醚砜濾膜過濾細胞上清液,以去除殘留的細胞碎片和其他雜質。


    9.慢病毒收獲:得到的慢病毒上清液即為經過純化和感染活性驗證的慢病毒,可用于后續實驗中對目標細胞進行感染(若病毒感染效率低,可使用試劑盒進行濃縮病毒)。


    10.慢病毒感染:將目的細胞接種于 6孔板中,待細胞貼壁后進行慢病毒感染,感染后48H,加入適量濃度的篩選藥物puromycin(具體濃度通過藥物篩選實驗獲得),24h后換液去除死細胞,繼續傳代維持培養。


    11.單克隆篩選:

    ①流式細胞術篩選:此法存在一些不足之處,其中包括重懸細胞后進行流式篩選的過程。因為這種操作可能導致細胞經歷多次振蕩,增加了細胞的脆弱性,細胞的生存狀況可能會受到不良影響,所以不太建議采用這種方式。


    ②無限稀釋法,將96個細胞稀釋至10ml培養基中,然后將其種植到96孔板中,確保每個孔內只有一個細胞。完成種植后,建議在觀察過程中每次僅觀察十個孔,因為長時間的外部觀察可能導致細胞受到應激損傷,影響后續的細胞培養,甚至會導致部分細胞死亡。進行單克隆細胞培養時,首先將細胞鋪在96孔板中,培養至細胞長至80%的融合后進行消化。隨后,將細胞傳到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中,以確保單克隆的純化。并非所有細胞都能成功生長,因此在考慮實際情況時,一般需要大約一兩個月的時間才能獲得理想的實驗結果。


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